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流式调补偿,知多少?

发布时间:2019/10/16 点击次数:1045 来源:US EVERBRIGHT INC.

小伙伴们做流式时通常会遇到调补偿的问题,为啥调补偿,不调补偿怎么样,怎么调补偿?小E哥在这里与大家一起分享自个儿关于调补偿的经历!


Ø  调节补偿,Why

图1分别为FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的发射光谱,其发射光谱范围一般在100-200nm之间,如同时用488nm的激光器去激发,虽然每个染料都有对应它最大发射波长的滤光片来接收荧光信号,但如果染料的发射光谱较宽,该染料的发射光就会被不止一个通道接收。

以图中的PE染料为例,PE通道接收的信号除了PE外还有FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7。为了我们检测的是单独的PE信号,就需要设置单染管进行荧光补偿的调节,进而去除其他荧光的干扰。

图1  FITC、PE、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的发射光谱

图2  将FITC、PE-eFluor 610、PE-Cy5、PE-Cy7的荧光从PE通道中去除的模式图


Ø  如何调节补偿,How

① 不加药处理的阴性细胞调节FFC、SSC电压,加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节该通道的电压。

② 加药处理的只加一种染料的阳性细胞调节补偿。

③ 补偿调节好后,用加药处理过的双染管上流式。

以调节FITC和PE之间的补偿值为例如下表进行设置:

样品序号

标记方法

目的

1

空白

阴性对照

2

标记FITC

去除PE通道中的FITC信号

3

标记PE

去除FITC通道中的PE信号

4

同时标记FITCPE

观察补偿后的调节效果

FITC单染管:FITC荧光渗漏到PE通道,我们需要设置FITC单染管,将渗漏进PE通道的FITC荧光信号去除,也就是得出PE-FITC补偿值。

PE单染管:PE荧光渗漏到FITC通道,我们需要设置PE单染管,将渗漏进FITC通道的PE荧光信号去除,也就是得出FITC-PE补偿值。


Ø  不设置补偿调节对结果有什么影响,If not?

有小伙伴觉得设置荧光补偿麻烦,哼,不设置了,那一起来看下结果吧。

如图3-A列所示是荧光补偿调节之前的流式结果,分别是FITC单染管、PE单染管、双染管的流式图,图3-B列所示是荧光补偿调节过度的流式结果,图3-C是补偿调节不够的流式结果,图3-D是荧光补偿正确的流式结果。

没有设置补偿调节组各个象限细胞比例与设置补偿正确组相差大,且分群不美观,而补偿调节不够或过度也会引起象限内细胞比例产生偏差,且分群不美观。

图3  补偿对结果的影响


Ø  哪些因素会影响补偿的调节?Which?

① 电压:电压变荧光补偿变,我们需要先调节FSC、SSC电压和荧光通道的电压然后调节补偿值。

② 荧光染料本身的光谱特性和荧光强度:先根据流式细胞仪的配制,包括激光器、光路设计以及滤光片等,确定有哪些染料可用,后选择发射光谱重叠较小的荧光染料。

③ 细胞:当细胞的理化性质相差较大时,流式结果可能不尽相同。如标记相同的荧光素偶联抗体,使用相同的通道,但样品细胞分别是活细胞与固定后细胞时,得到的流式结果可能就不一样。所以当细胞理化性质差异较大时,最好重新调节新的样品细胞的补偿,确保获得准确的流式结果。


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